各位同学大家好啊，在之前的推文中熊叔讲解了蛋白提取的方法：
一站式：蛋白提取方法汇总
那么今天我们来继续聊一聊蛋白裂解。
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俗话说，要想蛋白检测做得好，细胞你得裂的好。注意，熊叔这里说裂得好不见得是裂的干净，而是裂成最适合你实验的程度。那我们就不得不提到细胞/组织裂解液了，根据实验目的不同，我们需要不同的实验裂解液，而且在实验过程中，我们有时还会根据实验结果调整蛋白裂解液的成分。一般来说，我们现在实验室里用到的裂解液成分可以总结为：去垢剂+缓冲体系+蛋白酶抑制剂，从而实现细胞裂解：
去垢剂：破坏磷脂双分子层，从而裂开细胞
缓冲体系: 提供稳定蛋白的pH值和盐离子环境
蛋白酶抑制剂：抑制蛋白酶活性，防止蛋白被降解掉
接下来，我就具体的来讲解一下：
一、去垢剂
首先蛋白裂解液里面呢，大多数有效成分都是去垢剂（也被称为表面活性剂）。所有的去垢剂都具有亲水“头部”区域和疏水“尾部”区域这一特征。
这样的结构使去垢剂能够实现在溶液中存在足够量的去垢剂分子时，它们结合在一起形成称为胶束的结构。当胶束形成时，去垢剂头部会自行定位，以便暴露在水中，而尾部则聚集在结构的中心，免受水的影响。因此，胶束的疏水中心会结合到膜蛋白的疏水区域，溶解膜蛋白从而实现细胞裂解。
由于去垢剂的亲水头都带电。电荷可以是负电荷、正电荷或中性电荷。根据亲水头部的电荷性质，去垢剂分为阴离子、阳离子、非离子、或两性去垢剂。总体来看，
阴/阳离子型去垢剂：包括十二烷基硫酸钠（SDS）、N-月桂酰肌氨酸、CTAB等，作用强烈，能有效地破坏分子内和分子间蛋白质之间的相互作用，但容易使蛋白质变性，会更大程度的改变蛋白质的结构，更容易受到pH、离子强度和反离子的性质等因素影响；其中，胆汁酸盐也属于离子型去污剂，如胆酸钠、脱氧胆酸等
非离子型去垢剂：包括麦芽糖苷、葡萄糖苷和聚乙二醇。这类去垢剂的特点是亲水性头基不带电，性质温和、由于不分离蛋白质-蛋白质键，非离子型去垢剂使得蛋白质可以保留其天然的结构和功能，可以破坏蛋白质-脂质和脂质-脂质之间的相互作用。
两性去垢剂：包括Zwittergents, Fos-Cholines, CHAPS/CHAPSO等，这类去垢剂的亲水头部带有正电荷和负电荷。这些去污剂像非离子去污剂一样呈电中性，但它们通常能够像离子去垢剂一样破坏蛋白质之间的相互作用，因此中等温和。大多数成功的 NMR 膜蛋白研究都使用两性离子去污剂，例如 Fos-Choline 12。
就我们目前实验室常用的去垢剂做个总结：
SDS(基本会使蛋白变性失活) > Triton X-100≈Tween-20> NP-40
二、缓冲体系
1、pH缓冲液
蛋白裂解液里的重中之重就pH缓冲溶液，主要作用是维持pH相对稳定，因为裂解液pH过高或过低都会使蛋白质变性析出或水解。目前实验室常用的有：Tris-Hcl体系、磷酸盐体系（磷酸二氢钠盐和磷酸氢二钠盐混合溶液）、HEPES-NaOH等。使用浓度一般为50mM左右。选择pH缓冲体系时要考虑蛋白等电点，缓冲液的缓冲范围等因素。作为蛋白裂解液里的缓冲体系，用得最多的还是Tris-Hcl体系。
2、盐离子和螯合剂
一般在缓冲液中会使用100mM-200mM的NaCl或者KCl溶液来模拟生理状况下的离子强度。在提胞浆蛋白等易溶组分时，也有通过低盐而实现低渗，从而使细胞胀破以实现质膜分离，这种情况下NaCl的浓度不超过50mM。另外，当盐离子浓度过高时，部分蛋白可能会由于盐析而沉降。而且盐离子过高也会导致最后制成的蛋白样品中离子浓度过高，进而跑电泳的时候泳道内局部电流过大，会跑出笑脸状条带。一般NaCl的浓度不可高于500mM。
螯合剂一般为低浓度(一般使用1mM终浓度)EDTA主要作用是与金属离子络合，防止蛋白被金属蛋白酶降解，抑制核酸酶活性、调节渗透压和活化酶等。
3、还原剂
还原剂主要是为了防止蛋白质在纯化和储存的过程中半胱氨酸残基被氧化影响蛋白的活性。目前常用的还原剂有二巯基乙醇和DTT，其中二巯基乙醇的使用浓度为5-20mM，DTT使用浓度一般为0.5-1.0mM，使用时要注意DTT稳定性较差一般配成高浓度伫液并分装后于-20℃长期稳定储存。
三、蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂也是必须要添加的，作用是抑制蛋白酶的活性，避免蛋白过度降解。常用的蛋白酶抑制剂总结如下：
这里要注意的是，不同的蛋白酶抑制剂在水溶液里的半衰期是不同的，平时要注意储存条件。比如PMSF半衰期大约1小时，因此要在裂解细胞的时候临时加到蛋白裂解液里。
好了，对于蛋白裂解液里的每种成分，熊叔都做了基本的介绍，看到这，相信同学们多少都有点明白，不同的实验需求我们需要不同的裂解液，那么下面我来列出我们实验室常用的裂解液配方，以及每种配方适合何种实验：
（p.s. 以下配方没有包括蛋白酶抑制剂，根据实验的不同可人为选择增减蛋白酶抑制剂，本实验室无特殊情况一般默认添加1mM PMSF，或者有条件的同学可以直接购买商品化的蛋白酶抑制剂Mix，即市面上的100×Protease inhibitor cocktail）
1、RIPA裂解液
RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类，可制备成母液，避光保存。
强性RIPA裂解液
适用实验：WB，IP
配方：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% 去氧胆酸钠，0.1% SDS， 1 mM EDTA
中性RIPA裂解液
适用实验：WB，IP
配方：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%NP-40，0.5% 去氧胆酸钠，1 mM EDTA
弱性RIPA裂解液
适用实验：WB，IP，CO-IP
配方：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%NP-40，0.25% 去氧胆酸钠，1 mM EDTA
2、IP裂解液
IP裂解液是一种改良后的RIPA裂解液，具中等强度效力，可高效溶解细胞蛋白，但不会像RIPA一样释放染色体组DNA或破坏蛋白复合物。
适用实验：专用于Pull-down和IP的蛋白样本制备
配方：25 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40 和 5% 甘油
3、SDS裂解液
适用实验：WB（制样时添加5% β-巯基乙醇）
配方：50 mM Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝（如果需要BCA测蛋白浓度，不可以添加溴酚蓝），10%甘油
以上裂解液基本可以满足我们平时70-80%的实验，还有一些用得不是很频繁的配方：
4、NP-40裂解液
适用实验：用于提取胞质蛋白
配方：50 mM Tris，pH 8.0，150 mM NaCl，1% NP-40（可用 Triton X-100 替代 NP-40）
5、Tris-Triton 裂解液
适用实验：提取细胞骨架蛋白
配方：10 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1% Triton X-100，10% 甘油，0.1% SDS，0.5% 脱氧胆酸盐
好了，最后讲一些注意事项：
1、我们在做IP等实验室时往往需要某个标签的beads比如His-Agarose，proteinA/G Agarose等等，不同的填料有不同的说明书，有一些会提供缓冲液以及最适裂解液配方，这种情况下建议按照说明书的配方来。
2、提取不同亚细胞蛋白组分时往往需要不同的裂解液：
3、一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。需要将样品置于冰上或维持在 4 ℃ 下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的蛋白酶抑制剂，能够显著减缓这些反应。
4、抗体通常识别目标蛋白的一小部分（即称为“表位”），这一结构域可能位于蛋白质的三维结构内。要使抗体能够接近该部分，必须使蛋白质展开，即使其变性，所以需要前面讲的SDS裂解液，也被称为上样缓冲液（Loading buffer），并在 95–100 ℃ 下煮沸混合物 5-10 分钟。
5、某些抗体可识别由不连续氨基酸组成的表位。虽然组成表位的氨基酸在一级序列中相互分离，但它们在蛋白质的折叠三维结构中相互靠近，抗体只能识别折叠结构表面上的表位。在这种情况下，必须在非变性条件下进行蛋白质印迹，一般来讲，非变性条件即不向样品和迁移缓冲液中加入 SDS，并且不加热样品。还有一些抗体只能识别非还原形式的蛋白质（尤其是半胱氨酸残基），在这种情况下，上样缓冲液和迁移缓冲液中不应添加 β-巯基乙醇和 DTT。
6、如果只是要做IP或者CO-IP，建议使用IP裂解液，该裂解液在裂解细胞或组织后一般不会形成粘滞的透明状DNA团块，不必采用超声处理就可进行下一步操作。而且在做IP的时候IP不下来，排除掉抗体的原因外，一般需要调整裂解液里去垢剂的浓度。如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则需通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，如NF-κB等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
好了，就写到这里吧，最后祝大家实验顺利，我是老熊，别忘了点赞、转发、关注我，让我有动力继续分享！我是老熊，一个立志用通俗易懂的语言带你玩转科研的忍者~
参考文献
[1] J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]. 科学出版社, 2002.
[2] 林秋雄, 吴炳义. 生物医学基础研究使用手册[M]. 人民卫生出版社, 2021
[3] 陶永光. 肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册[M]. 湖南科学技术出版社, 2014.
