在过去的十几年中，RNA测序（RNA-seq）已经成为在转录组层面分析差异基因表达（DEG）和mRNA差异剪接的必备工具。时代和技术的进步下，RNA-seq也在进一步发展，基于更新的技术，RNA-seq可以在单细胞、翻译、空间等方向都有进一步的应用。与长读长技术的结合创新更是有助于更全面地了解RNA和转录乃至调控过程。
今天，我们一同回顾由剑桥大学James Hadfield教授等在Nature Reviews Genetics杂志上发表文章《RNA sequencing: the teenage years》，虽然文章发表于2019年末，但其全面总结了RNA-seq十余年的发展，囿于篇幅，挂一漏万，非常建议各位读者阅读原文。
RNA-seq至今已有近二十年的发展，为我们认知基因组功能助力巨大。RNA-seq最常用于寻找差异基因（DEG），也是如今最广泛的分析DEG的工具方法。同时RNA-seq的广泛应用极大地丰富了我们对于生物学方面的理解，如mRNA的可变剪接、ceRNA的网络等，给我们以前所未有的角度去理解RNA的生物学功能。但是RNA-seq技术大多还是基于短读长平台开发，新的长读长技术可以进一步解答短读长无法解答的问题。
图1.不同测序技术的工作流程
不同测序技术对比
短读长cDNA测序（RNA-seq）：是如今最常用的测序方法，基于整个转录组范围对基因进行检测和定量，相对于之前的微阵列而言，范围更广，价格也更为低廉，可以得到更全面和高质量的数据。基于短读长测序平台的方法学和应用已经十分成熟，无论是软件还是算法都已经得到了广泛应用与公认。但是其缺点也显而易见，因为读长受到技术限制，其对于长度较长。可变程度较高的转录本的检测会存在较大偏差。
长读长cDNA测序：PacBio（PB）公司和Oxford Nanopore（ONT）都提供了对应的长读长技术，对完整的RNA进行单分子层面的测序。整个过程去除了组装的步骤，因此得到了更为直接的长读长转录本，从而获得了更长、更完整的转录本多样性信息，降低了短读长RNA-seq中转录本分析的假阳性率。不过对比与短读长测序而言，三代测序通量还是过低并且对RNA的完整性要求也更高，这无疑为研究添加了更多的限制条件。
长读长RNA测序：长读长RNA测序则区别于长读长cDNA测序，减少了将mRNA转换为cDNA的过程，直接对RNA测序。这种测序技术不用cDNA合成和扩增，简称为dRNA-seq。这种测序方式的优势在于对转录本的检测和对于Poly（A）尾长度的评估，同时还可以进一步检测部分碱基修饰，但是该技术依然存在一定缺陷，比如对于样本的制备要求更高，测序的误差还没有明确清楚以及整体还处于发展之中。
图2.短读长与长读长 RNA-seq平台对比
总结：虽然整体而言，长读长测序具有明显优势，但是受限于通量和错误率，依然有一些弊端，并且会对RNA的要求更高。对于通量而言，可以利用长读长测序结合短读长测序的方式来结合，从而在保持转录本定量的同时，得到更高的转录本检出；对于误差问题，PB采用了CCS的方式来进行规避，不过这会影响整体的通量，受限于成本和技术，就目前而言，illumina的短读长依然还是主流。
RNA-seq的应用RNA-seq数据分析：RNA-seq探究差异基因的方式已基本成熟整体遵循：测序reads的比对和组装-转录本定量-过滤和标准化-差异表达的基本路径。整个过程中也有被广泛使用的软件如：StringTie、RSEM、DEseq2、EdgeR等。
图3.差异基因表达的RNA-seq分析流程
RNA-seq的应用展望：
①非bulk RNA-seq
RNA-seq还是站在整个组织或者细胞群体的角度来解答生物学问题，但是进一步探究必然会涉及到特定的细胞类型和空间信息的保留，因此进一步诞生了单细胞转录组（scRNA-seq）和空间转录组。其中scRNA-seq已经在推动大规模的细胞图谱项目，并且也已经有了越来越广泛的应用范围。ScRNA-seq已经在迅速的成为标准工具，并且可能和bulk RNA-seq一样被广泛应用。空间转录组则在表达的同时进一步定位了空间信息，不过二者技术均处于发展阶段，依然存在许多障碍。
②非稳定态RNA分析
RNA-seq除了通过DEG来分析mRNA水平，还可以分析转录和翻译过程中动态变化，这为研究基因表达提供了新的思路。进一步也就出现了针对新生RNA分析的研究，不过由于实验较为复杂，也处于发展阶段。
③RNA互作分析
RNA并非单一，研究基于试验方法或质谱技术等方法，进一步探究RNA与各分子的互作如RNA-RNA互作、RNA-蛋白质互作以及RNA的分子内互作，不过因为更多基于抗体、以及实验效率等问题，还需要进步发展。
总结：RNA-seq可以说是改变对真核生物RNA研究的重大方式，基于RNA-seq已经获取了许多基因组的功能、疾病的深度挖掘与调控机制探究。基于进一步三代测序技术以及空间和单细胞方向的探索会是后续的重要方向。当长读长测序可以达到短读长测序的通量与要求时，会取代短读长测序成为大多数研究的首选。对于RNA-seq的探究，再怎么预测都可能过于保守。
这篇对于RNA-seq技术的发展的综述是测序的经典之作，虽然受限篇幅，综述重点在探究真核生物的mRNA方向的技术发展，但是已经全面解析了RNA-seq的前世今生和后续发展。站在2024年的年初，单细胞技术的蓬勃发展，空间转录组的蓄势待发，无一不印证了作者在19年的推测。伴随着PacBio对Kinnex方法的提出，在三代测序上保证准确率的同时，更大通量、更低价格，是否能印证作者所言“长读长测序可以达到短读长测序的通量与要求时，会取代短读长测序成为大多数研究的首选。”
原文链接：Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019;20(11):631-656. doi:10.1038/s41576-019-0150-2
