看很多小伙伴不知道荧光定量怎么做，想想自己也算个荧光定量老油条了，我这里大概分享一下我的实验流程和一些小技巧，有需要的话可以参考一下。
我做的是B淋巴细胞的荧光定量，RNA提取出来的浓度大概250ng/ul，反转录用了4ul，cDNA的浓度就有1000多ng/ul了，反转录试剂盒是新贝的。
后面做荧光定量我们实验室用的是擎科的qPCR MIX，体系是10ul体系，cDNA模板加了1ul，用的仪器是QuantStudio 7 flex system，所以配体系的时候还要多加0.2ul的ROX。这里加样的时候我们有个习惯，因为我们用的体系比较小，单独一个个加的话误差比较大，所以我们是提前把要相同的组分预混好，后面再分装，这里有个要注意的地方，加样前一定要确保试剂完全融化了，然后一定要混匀！加样的时候可以点在壁上，之后一定要离心！血泪的教训。
对了，补充下我们加样用的是爱思进的透明PCR板，个人感觉透明的比白色的好用，封板膜我们用的是ABI的，除了贵没啥缺点。
然后扩增程序就按照说明书设置，熔解曲线用的仪器默认的，大概跑一个半小时跑完。
以下是我的部分结果
我这里用了不同的cDNA模板和相同的引物，CT值在20-31之间，熔解曲线都是单峰，最后结果算出来也是符合预期的。这里也有要注意的地方，不同公司的试剂的荧光强度天生就不一样，一起跑就会有高有低，但是结果跟高低没有关系，看CT值就行。但是像我们用的擎科的这款，如果跟其他的一块看的话就又矮又趴，那曲线就真心不好看。后来才发现这种就不能放一块分析，荧光强度差别大的要单独分析，像这个图上的就是单独分析，图就很漂亮。
之后就是分析结果了，一般重复性没问题，熔解曲线也没问题的，那数据就能用，照着公式代进去就行了，具体啥公式哪哪都有，我也不废话了。
荧光定量这个实验，刚开始做可能容易出问题，多做几次熟练了之后其实挺简单的，这也是我的一点个人经验，谁还不是从菜鸟进化过来的呢。
